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豬細小病毒及其鑒別診斷研究

手機:M版  分類:養豬技術  編輯:醉美人

  此外,本病還可引起產仔瘦小、弱仔,母豬發情不正常,久配不孕等癥狀。對公豬的受精率或性慾沒有明顯影響。

  4病變

  眼觀病變為母豬子宮內膜有輕微炎症,胎盤有部分鈣化,胎兒在子宮有被溶解、吸收的現象。感染胎兒還可見充血、水腫、出血、體腔積液、脫水(木乃伊化)及壞死等病變。

  組織學病變為母豬的妊娠黃體萎縮,子宮上皮組織和固有層有局灶性或彌散性單核細胞浸潤。感染胎兒死亡后可見多種組織和器官有範圍廣泛的細胞壞死、炎症和核內包涵體。在大腦灰質、白質和軟腦膜偶以增生的外膜細胞、組織細胞和漿細胞形成的血管套為特徵的腦膜腦炎變化,一般認為這是本病的特徵性病變。

  5診斷

  如果發生流產、死胎、胎兒發育異常等情況而母豬沒有明顯的臨床癥狀,同時有其他證據可認為是一種傳染病時,應考慮到本病的可能性。但最後確診必須依靠實驗室檢查。可將一些木乃伊化胎兒或這些胎兒的肺送實驗室進行診斷。大於70日齡的木乃伊化胎兒、死產仔豬和初生仔豬則不宜送檢,因其中可能含有干擾檢驗的抗體。

  本病應注意與豬偽狂犬病、豬乙型腦炎和布魯氏病等鑒別診斷。

  6防制

  本病尚無特效的治療方法。主要採取的措施:控制帶毒豬傳人豬場。在引進豬是應加強檢疫,當抗體滴度在1∶256以下或陰性是方可准許引進。引進豬應隔離飼養2周后,在進行一次抗體測定,證實是陰性者,方可與本場豬混飼。一旦發病,應將發病母豬、仔豬隔離或淘汰。所有豬場環境、用具應嚴密消毒,並用血清學方法對全群豬進行檢查,對陽性相豬應採取隔離或淘汰。以防進一步發展,對豬進行免疫接種,有良好的預防效果。美國一研製成弱毒疫苗和滅活苗,對初產母豬進行免疫接種,能有效預防母豬感染細小病毒。滅活苗免疫期可達4個月以上。我國已研製出滅活疫苗,在母豬配種前1~2個月左右免疫,可預防本病發生。仔豬的母源抗體可持續14~24周,在抗體效價1∶80是可抵抗豬細小病毒感染,因此,在斷奶時將仔豬從污染豬群移到沒有本病污染的地區飼養,可以培育出血清陰性豬群。

  綜合以上種種,鑒於細小病毒危害的嚴重性和臨床癥狀的不明顯性,早期診斷是預防的關鍵,所以找尋一種簡便、準確的實驗室診斷方法將是我們所要解決的首要問題。

  目前,我們已經建立了許多種細小病毒的診斷方法。主要包括(1)病原學方面:進行病毒的細胞培養和鑒定或血凝實驗或熒光抗體染色實驗。用熒光抗體檢查病毒抗原是一種可靠和敏感的診斷方法。但其需要熒光顯微鏡這一特殊的設備,因此限制了該方法在臨床的推廣。

  (2)血清學方面:血清中和實驗、血凝抑制實驗、酶聯免疫吸附實驗、瓊脂擴散實驗和補體結合實驗等,都可用於檢測本病毒的體液抗體。其中常規診斷方法是血凝抑制實驗。病料可採取母豬血清,也可用70日齡以上感染胎兒的心血或組織浸出液。被檢血清先經56℃30滅活,加入50%豚鼠紅細胞(最終濃度)和等量的高嶺土,搖勻後放室溫15min,經2000r/min離心10min取上清,以除掉血清中的非特異性凝集素和抑制因素。抗原用4個血凝單位的標準血凝素,紅細胞用0.5%豚鼠紅細胞懸液。判定標準暫定1∶256。但其存在一定的不足之處,如實驗所需的紅細胞要現配現用,最多只能保存1周,被檢血清的處理也較為煩瑣。

  可見,使用方便、經濟適用、簡單易行、準確可靠,適應規模化養殖的早期診斷和及時預防的需要的鑒別診斷方法為人們眾望所歸。為此,華中農業大學病毒研究室研製開發出豬細小病毒鑒別診斷試劑盒。

  7診斷試劑盒研製的生物學基礎

  細小病毒作為最小最簡單的一類單鏈線狀DNA病毒,具獨特的基因結構,其中多種自主型細小病毒的基因組結構非常相似。PPV具有細小病毒的一般特性,其基因組為單鏈線狀負性DNA。其兩端均為髮夾結構,3’端102個鹼基的迴文序列被2個大小約10個鹼基的短迴文序列間隔,從而形成“Y”形結構,而5’端127個鹼基的迴文序列,被24個鹼基的短迴文序列間隔,摺疊成“U”形結構。PPV基因組含有兩個互不重疊的主要開放閱讀框架(OpenReadingFrame)。位於3’端的主要編碼病毒結構蛋白(VP,VP2);5’端的主要編碼病毒的非結構蛋白(NSl,NS2,NS3)。非結構蛋白的功能表現為:

  (1)非結構蛋白在細小病毒DNA複製和RNA轉錄過程中具有重要作用,NSl蛋白具有內切酶作用和共價結合5’端序列的特性,從而能共價結合複製型DNA5’末端並具有特意部位的解鏈活動。NSl蛋白有A型保守序列,這類序列是與ATPase和GTPase相關的ATP和GTP結合位點,並具有解旋作用,它拓展了病毒DNA的末端的空間構型,起始病毒DNA的複製,所以NSl蛋白是細小病毒DNA複製所必需的。

  (2)NSl蛋白與細小病毒的組裝密切相關。PPV新合成的單鏈DNA基因組的5’端通過共價鍵與NSl聯結,在隨後的病毒包裝過程中NSl被去掉並連在病毒粒子的外層。

  (3)非結構蛋白NSl具有抗原性,並刺激機體產生抗體。NSl雖然是微量的,但在病毒複製中,能持續刺激機體產生抗體。當豬感染PPV后,體內將產生抗NSl的抗體,而使用滅活苗免疫的豬則沒有這種抗體一基於此,利用桿狀病毒體外重組表達的NSl建立了區分PPV野毒感染和滅活疫苗免疫豬的鑒別診斷方法

  8診斷試劑盒研製的過程

  本研究在對PPV中國株的NSl基因進行PCR擴增、克隆和序列測定的基礎上,進一步對細小病毒進行了深入研究,利用大腸桿菌表達系統成功表達了PPVNSl蛋白作為抗原,建立間接ELISA診斷方法。

  通過大量臨床血清的檢測證實:

  (1)特異性實驗:用NSl包被微孔板,分別檢測豬口蹄疫、豬偽狂犬等豬的陽性血清,檢測結果都呈陰性。表明,此診斷方法對豬細小病毒病的檢測具有特異性,是一種準確而使用簡便的診斷方法。

  (2)穩定性實驗證實診斷試劑盒在室溫下放置的有效使用期可以達到5個月。

  (3)靈敏性實驗證實其比常規的診斷方法,如HI和LAT等更為靈敏,尤其可以鑒別診斷自然感染和滅活苗免疫豬群。

  (4)此診斷方法對於大量血清檢測具有省時、便捷、準確的特點,更適應規模化養殖的早期診斷和及時預防的需要。

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