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藍耳康針對豬肺泡巨噬細胞保護作用研究

手機:M版  分類:養豬技術  編輯:眾疇

  豬藍耳病毒(PorcineReproductieandRespiratoUSyndromeVirus,PRRSV)最顯著的生物學特性是對(PAM)的親嗜性,首要攻擊具有重要免疫作用的豬肺泡巨噬細胞(PAM),在病豬的肺臟病毒滴度可達105TCID50/g,占肺臟受感染細胞的80%~94%,導致豬肺部病變,肺氣體交換受到嚴重影響,併產生大量痰液堵塞支氣管,造成機體全身缺氧,豬身體因缺氧而發困,嗜睡,全身酸痛(和人患重流感類似)。岳陽市信德科技投資顧問中心豬高熱病防治研究所與湖南廣大畜牧獸醫研發有限公司共同研製的中藥復方藍耳康,含有大量水溶性特種抗病毒蛋白、殺滅病毒的生物多酚、生物多酮和萜類成份,對豬藍耳病有很好的臨床效果,但對豬藍耳病毒(PRRSV)誘導的豬肺泡巨噬細胞PAM凋亡是否具有保護作用,未見文獻報道。本實驗用細胞培養方法,觀察藍耳康對豬藍耳病毒PRRSV誘導的巨噬細胞PAM凋亡時的細胞存活率、DNA和凋亡率的變化,探討藍耳康對豬藍耳病毒(PRRSV)誘導豬肺泡巨噬細胞PAM凋亡的保護作用。

  1 材料與方法

  1.1 藥物及試劑

  藥物的製備:取藍耳康100g,按常規煎煮,過濾,濃縮,製成100%濃度的藥液。

  試劑:MTT用PBS配成5g/L。碘化丙啶、RNaseA、蛋白酶K購自Sigma公司。FCS、DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司。TX.114購自Anlresco公司。苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇等為國產分析純。

  1.2 PRRSV病毒增殖與純化

  豬藍耳病毒株(PRRSV)來自中監所;MARC-145細胞長成單層后,將PRRSV病毒接種於長滿單層的MARC-145細胞,37℃吸附1h。加入含2%FCS的DMEM營養液37℃培養2~3天,細胞病變(CPE)達70%時,收穫病毒細胞。反覆凍融3次,2000r/min離心30min(4℃)。取上清液於90,000×g離心2h(4℃)。棄上清,加入1/100原體積PBS,4℃懸浮過夜;取出經30%~60%蔗糖密度梯度,120,000×g離心3h,收穫病毒帶於-20℃保存備用。

  1.3 細胞培養

  豬肺泡巨噬細胞系PAM購自中國農業大學細胞生物學研究中心細胞庫。用含體積分數為10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈黴素的RPMI一1640完全培養基,37℃、5%CO2條件下培養。細胞呈單層生長鋪滿培養瓶後用0.25%的胰蛋白酶消化傳代,選取對數生長期細胞做實驗。

  1.4 實驗分組

  待細胞生長至80%時,換新培養基將細胞分為三組:對照組(不含PRRSV的完全培養基);PRRSV處理組(完全培養基+PRRSV);藍耳康處理組(完全培養基+藍耳康);預處理1小時后加PRRSV處理24小時(完全培養基十藍耳康+PRRSV)。

  1.5 MTT法檢測細胞活力

  取對數生長期細胞.以2*104/孔接種於96孔培養板,200μL/孔。在37℃、5%CO2條件下培養過夜后,按分組要求給以不同處理因素,每組設4個平行孔。培養24h后,每孔加5g/LMTT20μL,再培養4h,傾去培養液,加DMSO150μL/孔,待紫色結晶完全溶解后,用酶聯免疫儀在波長570nm處讀取吸光度(OD)。取4孔OD值的均數按公式計算細胞存活率。

  細胞存活率()=實驗組OD/對照組OD*100%。重複3次。

  1.6 細胞DNA片段化分析

  收集細胞,用冰冷的PBS洗2次,胰酶消化,培養基(含血清)中和,離心收集細胞(800rpm,5min),再用PBS洗兩次。加入500LDNA消化緩衝液,室溫放置10min,再加2μL20mg/mL的RNaseA,37℃,lh;再加入5μL20mg/mL的蛋白酶K,55℃,lh;離心后加入等體積抽提液(酚:氯仿:異戊醇25:24:1),9000rpm離心15min;取上清至另一EP管,加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉,再加入2.5倍體積100%乙醇一20℃沉澱過夜;12000rpm離心10min;30LTE溶解DNA。每樣品取8μLDNA於1.8%瓊脂糖凝膠電泳。

  1.7 碘化丙啶(PI)染色流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡

  藥物處理24h后,用質量濃度為2.5g/l胰蛋白酶消化貼壁的PAM細胞,1000rpm離心10min,去上清,PBS漂洗2次,沉澱中加人體積分數為0.70的冰乙醇固定。1000rpm離心10min,去上清,PBS漂洗2次,調整細胞濃度為1*106/L。加50μLRNaseA(質量終濃度為lg),37℃水浴30min。加PI至質量終濃度為50mg/L,350目尼龍網濾膜過濾去除細胞團塊,4℃避光染色30min后,上流式細胞儀檢測(激發波長:488nm;發射波長:610nm)各期細胞DNA的含量。測定數據按流式細胞儀所配置的軟件進行數據處理,以DNA直方圖出現低於G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細胞的多少。

  2 結果

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